藥融會第174期專享會嘉賓：王良友 蘇州天馬多肽負責人

王良友 博士

一 個人簡介

王良友，1994年以來一直從事多肽藥物的合成與研發工作，熟悉多肽合成與分析方法，特別對多肽合成中困難序列的預測與對策、二硫鍵的形成方法、環肽合成方法及多肽的PEG化、磷酸化、糖基化等修飾方法有深入的研究。參與或主持完成的研究項目有：國家自然科學基金重點資助項目（39430120），國家自然科學基金青年科學基金項目（30300436），NIHgrant CA 1142994，國家科技重大專項課題重大新藥創制（2011ZX09102-001-16）。

已開發規?；a工藝的多肽仿制品種有：胸腺法新、奧曲肽、特立加壓素、去氨加壓素、比伐盧定、依替非巴肽、舍莫瑞林、生長抑素、亮丙瑞林、德舍瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林、縮宮素、卡貝縮宮素、西曲瑞克、地加瑞克、加尼瑞克、普蘭林肽、蘭瑞肽、特立帕肽、鮭降鈣素、艾塞那肽、利拉魯肽、索馬魯肽等。其中2個多肽原料藥已獲得中國GMP證書，4個通過CDE技術審評，1個獲得韓國KDMF證書。合作參與多肽創新藥工藝開發品種有血管抑肽（2016年獲臨床批件）、抗菌肽（2018獲臨床批件）等。

二 多肽介紹

今天和大家分享的是多肽合成關鍵工藝雜質的控制。

多肽就是把氨基酸有序的組合而成的分子，把氨基酸一個個的通過縮合反應形成酰胺鍵，然后就可以得到多肽。

多肽分子有大有小，小的可能就兩個或三五個氨基酸組成。大的可能由幾十個氨基酸組成。例如胰島素，就有兩條鏈，一共51個氨基酸組成。天然氨基酸主要有以下20種。

從全球的醫藥市場來看，目前統計的數據大概是1.17萬億美元。這里面多肽藥物其實只占約2%，目前上市的多肽藥物大概有80多種。2018年全球多肽的銷售額直接銷售大概也在288個億。

這是2017年和2018年多肽要去的銷售排行榜！

多肽的化學合成已有一百多年的歷史，最早發現多肽合成是德國的科學家，他們因此而獲得了諾貝爾獎。1965年的時候，我國首次人工合成了胰島素，這是一件比較轟動的事情。當時由北大、上海有機所、上海生化所等單位聯合攻關完成，并把我國的多肽產業從零開始，逐步發展到現在，形成了一個非常完整的產業。

在多肽化學的歷史上，有不少的科學家獲得諾貝爾獎，其中英國的桑格兩次獲獎。Merrifield和Tam教授多次來參加中國國際多肽會。

三 多肽合成里面的雜質控制

下面分享多肽合成里面的雜質控制，實際上首先要從合成策略上考慮。

目前多肽的合成主要是分化學合成法和生物法?；瘜W合成法，我們用的比較多的是固相法和液相法，生物法有發酵法，酶法，基因工程重組法。這幾種方法的話各有優缺點，在做生產的時候可能會采取多種方法。比如說在固相合成里邊，可能也會兼顧液相合成。液相合成里也可能也會用固相法來做一些片段。因此，現在合成多肽的方法是比較多的。

固相法，可能我們首先要考慮的就是樹脂的選擇，樹脂是我們固相合成的載體，非常重要。我國的南開大學和西安的藍曉，都在這方面做得非常好。

多肽合成里最基本的反應是縮合反應，要把兩個氨基酸縮合形成肽鍵。多肽合成用到的縮合劑已經歷了好幾代，基本上我國都能生產。

為什么固相合成多肽能得到大家的認同，主要就是它在操作上非常的簡便，因為做合成的人都知道，化學反應最難的就是反應的后處理。固相合成，就是把這個后處理進行了簡化。自1963年美國的Merrifield教授發明固相多肽合成以來，一直到現在都非常受歡迎。因為在工廠里，做合成的不可能人人都是有機化學專業的，往往是需要一些操作工，固相合成就非常適合簡單的操作工人，甚至自動化都可以實現。雖然它不是很經濟的一種方法，但是現在還是一個主流的多肽生產方法。

目前化學合成多肽藥物的審評是按化藥來進行的，所以在藥學研究上，跟小分子合成藥物基本上是相似的。主要研究的內容包括原料藥制備工藝的研究，結構確證，制劑處方研究，質量研究和穩定性研究等內容，和其它化藥基本上是一樣的，只是多肽可能有自己的一些特點而已。

胰島素肯定算是一個多肽，但是用化學合成來做的話，它的成本肯定沒有生物法有優勢，一般能用生物法做的多肽，它的成本會比化學法低很多。比如說國外的利拉魯肽，它的主鏈就是用生物法重組的，只是它最后有一個化學修飾，所以利拉魯肽這個產品，原研在價格上有很大優勢的?，F在仿制的大多是化學合成，在成本上是沒有優勢的。

胰島素這個產品它是屬于比較復雜的多肽，也可以歸到蛋白質里面去。因為它有兩條鏈，有三對二硫鍵，在合成上難度比較大，如果用化學合成來做，成本沒法給生物法相比，所以現在市場上所有的胰島素都是由基因重組的方法得到的。

無論是做多肽仿制藥，還是多肽的創新原研藥物，其申報資料現在都是要求按CTD格式來提交。

CTD格式的核心內容實際上也是DMF文件的主體部分，模塊2是質量綜述，其中2.3S3.2是合成工藝里邊的雜質研究，它要求列出所有的雜質及其分析，而且對雜質要能有效的控制，溶劑殘留也屬于雜質里邊要研究的重要內容。

DMF文件模塊3里對雜質的研究提出了非常具體的要求，做DMF文件的話，要花很多的精力做的就是3.2S3.2里雜質的研究和控制。

對于做藥的人來說，目前雜質譜這個概念是比較流行的。因為多肽的合成工藝比較復雜，所以它的雜質種類也比較多，需要開發多種控制方法。以前多肽藥物仿制的重點主要把產品做出來，符合原研或藥典上的質量標準。但是現在的審評思路是不一樣的，它要求你從起始原始物料開始，整個過程都要控制，也就是說我們以前“以終為始”的被動模式，必須轉變為“以源為始”的主動控制模式。

用生物法生產的多肽產品，就多肽本身來說，它的結構和純度應該是沒有問題的，但是它的挑戰是來源于你的宿主蛋白，還有外源基因殘留這些雜質的，要去做這方面研究的話，比化學合成多肽雜質要復雜得多?；瘜W合成多肽只是集中在化學結構的鑒定，包括雜質上進行控制，但它沒有生物學方面的其它雜質，如雜蛋白或者是宿主的DNA的一些研究內容。所以國內大多數多肽仿制還是喜歡用化學合成法，因為生物法的多肽仿制產品，還需要有臨床試驗。

以前，如果原研的多肽藥物是生物法的，仿制產品也必須要做臨床試驗，法規上不認同仿制地位，這有點像生物藥里面法里的Biosimilar，比如抗單抗之類的產品，每一個產品都必須要做臨床試驗。但是這兩年FDA也改變了一些規則，它認為無論是生物法還是化學法的多肽，如果你能把結構解析清楚，就可以算仿制產品。比如原研是是生物法的，你用化學法合成，你證明它的結構和活性相同，那就可以按仿制藥來申報，這樣大大減少了以前法規上的障礙。

正是由于這個原因，所以國內的絕大多數的多肽仿制產品是用化學合成，這樣審評也要快一點。比如說前幾年有一個產品特立帕肽，原研是生物法的，國內有企業申報了這個產品，由于做了臨床研究，整個的研究研究周期就非常長。因此，化學合成法的仿制在申報研發費用和獲批時間上都有優勢。

要研究多肽合成的工藝雜質，那究竟有哪些雜質？其實最容易想到的就是工藝缺失雜質，因為固相合成的話，不可每一步都是百分之百的縮合，難免會有某些氨基酸的缺失，而且多肽鏈本身有可能會發生斷裂，有些結構可能被修飾。這些雜質就是研究的重點，屬于工藝雜質。

還有一類是降解雜質，比如說有的氨基酸容易發生水解，或被氧化，甚至形成聚合。ICHQ3還要求對溶劑殘留與元素雜質、基因毒進行研究和控制。目前申報多肽產品的話，除了前兩類雜質以外，后面的溶劑殘留，元素雜質，基因毒雜質都要考慮。

而且現在按照CDE審評的要求，對雜質的來源、去向，尤其是起始物料的質量控制，都大大提高了要求。

起始物料的控制，最先想的就是氨基酸，因為氨基酸里邊的雜質有可能會傳遞到多肽的產品里邊去，那怎么來控制？

多肽合成用到的氨基酸種類比較多，這里舉一個例子，比如經常用的雙保護賴氨酸。L型的賴氨酸，它有可能包含D型的雜質。另外，這個雙保護氨基酸的制備過程當中，它可能會缺失一個保護基，還有形成一個二聚體，還有也可能引入貝塔丙氨酸，甚至這兩個保護劑的位置互換，或者兩個保護基都掉了。這些雜質都有可能會帶入到產品里去，所以在起始物料控制的時候，需要分析這幾類雜質。

剛才只是以一個氨基酸為例，但是多肽合成里面，往往會用到幾種甚至十多種的保護氨基酸，那么起始物料的控制對于分析部門來說，QC就要做大量工作。

多肽合成除了從物料的源頭氨基酸去控制雜質以外，還有更重要的是在合成過程中的控制。如何確保在多肽合成過程當中每一個氨基酸的縮合都完全？用的最多的是茚三酮檢測法，這個反應非常靈敏的，作為一個定性的中控方法，目前是大家普遍采用的。還有其它的方法，比如TNBS法，四氯苯醌法。如果要控制更好的話，國外有用LC-MS法的，每一步的縮合反應，包括脫保護基（Fmoc）都可以得到更精確的控制。但是考慮到這個生產周期等方面的原因，國內的中控方法還是比較弱的，一般就用茚三酮檢測法，或者是在關鍵控制點，也用LC-MS來跟蹤反應是否縮合完全。正是由于在中控的地方不是那么完善，所以導致后期的純化及在產品質量上往往面臨不小的挑戰。

多肽產業的迅速發展得益于下游技術的發展。一方面是大規模的制備液相設備的發展，以前的制備液相都是比較小的，就直徑幾厘米的柱子，現在直徑幾十厘米的柱子也是很常見的，直徑達到一米的制備柱子也是有的，而且都已國產化，因此多肽的產能大大提高，可以實現公斤、幾百公斤或噸級生產。還有方面就是填料的多元化，以前可能有的雜質很難去除，現在如果篩到合適的填料，可以把以前一些很難去除的工藝雜質，包括降解雜質都可以得到有效的分離，大大提高產品的質量。

還有一個方面就是現在的分析手段越來越多，越來越靈敏。新的分析設備和新方法層出不窮，有助分析這個整個工藝過程當中產生的雜質，跟蹤這些雜質在產品里邊是否存在。

中間體的質量控制也是審評老師比較關注的。因為多肽的生產周期比較長，需要設置盡可能完善的控制點。除了在起始物料和反應過程控制外，還可以采取一些策略，比如說有些長肽可能很難合成，就可以先做一些片段再進行片段縮合，往往降低合成的難度，還可以縮短整個合成的周期。多種策略可以用來實現工藝改進，雜質控制，質量控制。

這張表里列出的多肽合成工藝雜質類型是比較完整的。第一類就是消旋異構體，氨基酸大多數有手性中心，L型變成D型或者D型變成L型，這是最常見的一種雜質。第二種就是酰胺的水解，因為多肽里面有的氨基酸含有酰胺結構，或者它末端本就是酰胺結構，就容易產生水解雜質。另外還有一類就是缺失肽。這三類雜質是以前關注比較多的。這兩年EP和USP里又提出插入肽（就是合成工藝里邊可能會多插入一個氨基酸）雜質，氧化雜質，消除雜質等類型，

正是因為多肽合成工藝里的雜質比較多，所以申報一個多肽產品需要做大量的研究工作。雜質研究是非?；ㄥX費時的一項內容，但是這部分工作最能體現多肽合成研究的水平。如果這一項工作做好，通過審評的機會就會大很多。這幾年隨著國家審評要求的提高，不停地發補，我們也提高了的多肽合成工藝開發、雜質控制、產品分析等能力。

由于多肽固相合成的特點，要想做到99%的總收率是很難的。通過純化做到純度99%以上的產品是可以的。就合成而言，你每一步的縮合反應只達到99%還不夠，最好是要接近100%。

多肽的純度，可以通過工藝控制，包括純化和分析手段來提高?，F在做多肽生產的廠家比較多，最核心的競爭力就是產品的質量，也就是雜質控制水平，還有一個就是生產成本。如果你這兩點中任何一點做不到的話，你的產品是沒有競爭力。

舉一個具體的例子來看看多肽雜質。比伐盧定是用量比較大的一個多肽產品。它的來源就是來源于中藥，大家可能知道南方有一種動物叫螞蟥，也叫蛭，它能分泌出一個抗凝的多肽，這個多肽叫水蛭素，天然的結構有六十多個氨基酸的。后來經過結構改造，把它的氨基酸去掉一部分，只保留了與凝血酶結合的C末端的12個氨基酸和一個小片段，最后用幾個甘酸連到一起就形成了20肽。這個產品就是現在臨床上由于止血的比伐盧定。在USP的個論中，比伐盧定的質量標提到的雜質有4個：第5位甘氨酸可能會多一個或缺少一個的雜質，第9位的天冬酰水解變成天冬氨酸，還有13位的這個谷氨酸有可能會缺失的。但在工藝研究中，至少要研究二、三十個或更多的雜質，不大可能說只做這4個雜質研究就能過關的。大多數的多肽研究，雜質一般都是做到幾十個，甚至有一百多個雜質的。

這里就舉一個我們做過的實例，這個多肽含有四個半胱氨酸，形成二硫鍵有三種方式，那我們想要的是第一種結構，也就是6位和12位，7位和14位分別形成了兩個二硫鍵。如果這個二硫鍵錯配以后，就可能形成異構體1和異構體2。那我們怎么來保證合成的結構是正確的？

要解決這個問題，首先就要考慮半胱氨酸的保護問題。半胱氨酸的保護有很多選擇的。如果多肽只含有一對二硫鍵的話，就選相同的保護基團，脫除保護后一步環化就可以形成二硫鍵。如果多肽鏈含有四個半胱氨酸，需要形成兩對二硫鍵，這個時候就可以采用正交保護的策略，把半胱氨酸分為兩組，用不同的保護基團保護，分兩步脫保護，兩步環化可以得到正確配對的二硫鍵結構。如果有三對二硫鍵，就可以考慮采用三組保護基團，分三步環化得到目標化合物。多肽合成里面多對二硫鍵的正確形成是一個比較難難的問題可以靠化學保護策略來解決這個問題。

先采用兩組保護基，分兩步環化分別形成二硫鍵，可以得到目的肽。

采用同樣的策略，用兩步環化的方法制備個兩個異構體。

采用第一種方法合成，兩步環化，總收率不高。在得到兩個異構體和目標產物以后，可以通過優化環化條件，一步環化就形成目標化合物。

通過異構體定位，然后優化環化方法，通過一步環化，就能保證得到的主要的產品就是目的肽，這樣既能保證產物的結構正確，而且收率提高，生產成本明顯降低。

例（1）提到的多肽有兩對二硫鍵，有可能會錯配。例（2）是鮭魚降鈣素，它只含有一個二硫鍵，但是這個二硫鍵可能形成一個三硫化合物的雜質，這個也是比較少見的。它的形成過程，先通過二硫鍵打開，然后發生部分消除，然后再形成一個三硫化合物。

例（3）看到的是在主峰的前邊和后邊各有一個離的很近的雜質A和B，它離主峰很近，而且含量也不高，要想搞清楚它們的結構是比較困難的。雜質A實際上是因為谷氨酸的側鏈羧基參與肽鍵的形成。雜質B的可能是從原料里邊帶過來一個貝塔丙氨酸，也有可能在合成中會形成，就插入了一個貝塔丙氨酸。

這兩個雜質在多肽產品里面是比較難發現和去除的。它的形成可能從原料帶過來，也可能在合成過程中產生，它們代表了是多肽合成里邊比較有挑戰的這兩類雜質。

最后再看一個例（4），就是多引入一個氨基酸，為什么它會多引入一個氨基酸？因為脯氨酸是一個亞胺結構，這個氨基有一定的堿性，Fmoc保護基對堿不是很穩定的。也就是說在反應過程當中，如果操作不當，樹脂上的Fmoc保護基可能部分脫除，導致溶液中的Fmoc保護氨基酸再次偶聯到序列中。

多肽合成的雜質，從理論上講它的組合是很多，所以不太可能全部搞清楚，一般是通過分類來研究和控制。主要采用間接法，先設計合成系列可能有的雜質，然后通過高效液相色譜的定位方法，把這個雜質和目標產品能分離，排出產品中有某個雜質或定量某個雜質的含量。

四 小結

多肽就本質上來說，它和小分子的化學藥物，從化學結構來說都是類似的，要想把多肽的質控做好，就需要開發多種分析方法?；陔s質譜的概念，就是從氨基酸源頭及生產全過程進行控制。這張圖是今年的一篇文獻里邊提到的新方法，用高分辨力的核磁（800M）來進行多肽結構解析。隨著多肽研究的深入，雜質的控制也是將隨著新方法的出現而不斷發展，而且產品質量得到更有效的控制。